به دام انداختن فسفوپروتئین ها از طریق الکتروفورز تمایلی در حضور فلز تثبیت شده و کاربرد آن در پیام رسانی سلولی در نمونه های مغز ماهی زبرا

در الکتروفورز تمایلی با فلز تثبیت شده (imaep) از اصول کروماتوگرافی imac استفاده می شود، که در آن یون فلز به ترکیب ژل پلی آکریل آمید اضافه می شود. اگرچه در این پروژه از یون های سه ظرفیتی آهن جهت به کارگیری در imaep استفاده شده است، اما یون های فلزی دیگر نیز قابل تثیبت کردن هستند. ژل الکتروفورز باحضور fecl3 تثبیت شده می تواند برای غنی سازی فسفوپروتئین ها به کار رود، به طوریکه پروتئین های غیر فسفریله می توانند از بخش fecl3 عبور کنند بدون اینکه به دام بیفتند. پروتئین های به دام افتاده در fecl3 می توانند از ژل استخراج شده و مجدداً الکتروفورز شده و آنالیز شوند. برای به دام اندازی فسفوپروتئین ها در نمونه هایی با ابعاد و مقیاس کم مانند مغز ماهی زبرا از imaep در حضور sds استفاده کردیم. موارد زیر بررسی شد: 1) در الکتروفورز کل محتوای نمونه های پروتئینی مغز ماهی مستقیماً در ژل الکتروفورز ریخته شده و همه ی پروتئین ها در ژل وارد می شوند، در نتیجه مقدار بسیار ناچیزی از نمونه های پروتئینی در طول مراحل آزمایش هدر می رود که قابل صرفه نظر کردن است. 2) از آنجاییکه در ژل imaep پروتئین های فسفریله ای که از ناحیه ی کلریدآهن تثبیت شده عبور می کنند در این منطقه به دام می افتند، شدت باند پروتئین های غیر فسفریله در ناحیه fecl3 نسبت به پروتئین های کنترل که از ناحیه ی fecl3 نمی گذرند کمتر است. چنانچه پروتئینی به هر دو فرم فسفریله و غیرفسفریله وجود داشته باشد که به سختی تحت سیستم های ساده ی الکتروفورزی قابل تشخیص اند، فرم فسفریله ی این پروتئین در ناحیه ی کلریدآهن تثبیت شده ی imaep به دام خواهدافتاد و فرم های غیرفسفریله از این ناحیه عبور می کنند، بنابراین شدت باند در مقایسه با بخش کنترلی کم می شود، در حقیقت قسمت کنترل شامل پروتئین های فسفریله و غیرفسفریله است. در مورد پروتئین هایی که از نظر ساختاری فسفریله هستند، دیده می شود که باندهای مربوط به این پروتئین ها با عبور از ناحیه ی fecl3 تثبیت شده، از بین بروند درحالیکه این باندها همچنان در ناحیه ی کنترلی وجود دارند. 3) مشاهده می شود، با تحریک مسیر پیام رسانی سلولی، جهت تنظیم پروتئین های فسفریله، تغییرات سریع و یا تدریجی و اندک در الگوی باندهای این پروتئین ها در حضور fecl3 تثیبت شده رخ دهد که این تغییرات به دلیل فسفریلاسیون و دفسفریلاسیون پروتئین ها است. این مشاهدات در ناحیه ی کنترل اتفاق نمی افتد و تغییرات الگوی فسفوپروتئین ها در این ناحیه تنها پس از رنگ آمیزی های ویژه ی فسفوپروتئین ها و یا انجام وسترن بلات قابل تشخیص است. به عبارت دیگر در تکنیک imaep، تغییرات الگوی فسفوپروتئین ها به طورمستقیم، قبل و بعد از تیمار نمونه قابل مشاهده است. این مطالعات در حضور داروهایی که مسیر پیام رسانی سرین/تره دونین پروتئین کیناز c را فعال می کنند (مانند atp، گلوتامات و استیل کولین) در مغز ماهی زبرا انجام شد، بطوریکه پروتئین هایی که تیروزین آنها فسفریله شده کاهش پیدا می کنند. این باندها در بخش fecl3 به طور کامل حذف شده اند. کاهش در پروتئین های فسفریله در اسیدآمینه ی تیروزین، در سلول های مزانشیمی مغز استخوان نیز مشاهده شد. مشاهده ی تغییرات در ژل الکتروفورز با رنگ آمیزی“stain all” که ویژه ی رنگ آمیزی فسفوپروتئین ها است انجام شد. در این رنگ آمیزی فسفوپروتئین ها و پروتئین های اسیدی آبی رنگ شده و پروتئین های غیر فسفریله قرمز رنگ خواهند شد. از آنجاییکه حساسیت رنگ آمیزی “stain all” پایین است، از روش وسترن بلات و استفاده از ecl و آنتی بادی فسفو تیروزین، به منظور مشخص کردن این مطلب که نوار fecl3 ایجاد شده در ژل پلی آکریل آمید می تواند بیشتر فسفوپروتئین ها را به دام اندازد، استفاده کردیم.